Diego Klattenhoff est né en Nouvelle-Ecosse et a vécu à Toronto où il a pris des cours de théâtre jusqu’à l’âge de 19 ans. Il débute sa carrière au cinéma en 2002 avec « Straight in the face » mais son premier grand rôle arrive en 2004 avec « Mean Girls » où il joue aux côtés de Lindsay Lohan et Rachel McAdams.
Les téléspectateurs l’ont aussi vu dans de nombreuses séries télévisées telles que « Smallville », « Psych », et « Supernatural » mais aussi dans « Men in Trees », « 24 » et « Whistler ». Il est aussi la vedette du film de J.J Abrams, « Hope against hope ».