Alors qu'elle n'a que 12 ans, Eliza Dushku débute sa carrière d'actrice. En effet, c'est dans le film That Night (Craig Bolotin, 1992) qu'elle donne la réplique à Juliette Lewis. On lui propose ensuite un rôle dans Blessures Secrètes (Michael Caton-Jones, 1993) dans lequel elle retrouve un Leonardo DiCaprio débutant et un Robert de Niro qui n'a plus rien à apprendre. En 1994, elle incarne la fille de Arnold Shwarzenegger et Jamie Lee Curtis dans True Lies (James Cameron). Si sa carrière au cinéma semble déjà tracée, c'est à la télévision que la jeune actrice va véritablement être remarquée. Quand elle passe l'audition pour un rôle dans Buffy contre les vampires, elle est loin de se douter que sa rencontre avec Joss Whedon, le créateur de la série culte, va sceller son avenir. En effet, c'est grâce au personnage de Faith Lehane, une tueuse de vampire amie puis ennemie de Buffy (Sarah Michell Gellar), qu'elle se fait une place à la télévision. Elle participe ensuite à plusieurs épisodes de la série dérivée Angel où elle reprend le personnage de Faith.
Entre temps, bref retour au cinéma pour la jeune actrice : c'est aux côtés de l'actrice Kirsten Dunst qu'elle joue dans le film American Girls où elle enfile cette fois-ci non pas le costume d'une tueuse sanguinaire mais d'une cheerleader.
En 2003, elle est au cœur de la série Tru Calling, dans laquelle elle incarne Tru Davies, une jeune femme capable de revivre les journées pour sauver les innocents.
En 2009, elle retrouve celui qui lui avait donné sa chance dans Buffy contre les Vampires, Joss Whedon. Il lui offre le rôle principal de sa nouvelle série intitulée Dollhouse, et diffusée sur la chaîne FOX.